豌豆內(nèi)源基因PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

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注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)謩e配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
正庚烷(無(wú)水級(jí),99%)CD3 (17A2) Rat mAb (APC Conjuga)噻唑

三十六烷(standard for GC,≥98.0%(GC))PHB1 Antibody基肼鹽酸鹽

三十六烷(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.0%(GC))PHB1 Antibody4,5,6,7-四氫噻吩[3,2-c]吡啶鹽酸鹽

alpha-六六六標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=3%)EML4 Antibody2-甲基基

alpha-六六六標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=6%)Met (D1C2) XP® Rabbit mAb  (HRP Conjuga)雙酮酰

alpha-六六六標(biāo)準(zhǔn)溶液(50μg/mL,分析標(biāo)準(zhǔn)品)Thioredoxin 1 (C63C6) Rabbit mAb溴吲哚-2-甲酸

正十六烷(Standard for GC,>99.5%(GC))NeuN (D4G4O) XP® Rabbit mAbN-叔丁基-5-溴-2-噻吩磺酰

正十六烷(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.5%(GC))NeuN (D4G4O) XP® Rabbit mAb基肼鹽酸鹽

正己(Standard for GC,>99.5%(GC))PPARγ (D69) Antibody1,2-環(huán)氧環(huán)戊

正己(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99.8%(GC))Phospho-Shc (Tyr317) Antibody1H-并咪唑-2-甲酸

十六(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.5%(GC))CD16 (D1N9L) Rabbit mAbDL-alpha-甘氨酸

正庚酸(Standard for GC)Shc Antibody溴

正庚酸(標(biāo)準(zhǔn)品)Calnexin Antibody2-甲基-3,5-二甲酸

1,6-己二(standard for GC)Phospho-Shc (Tyr239/240) Antibody2-溴-6-羥基吡啶

2-庚酮(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.8%(GC))Phospho-Shc (Tyr239/240) Antibody6-氟吲哚-甲

十七烷(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.5%(GC))PPARγ (C26H12) Rabbit mAb氨基-2--硝基吡啶

三十一烷(Standard for GC≥97.0%(GC))PPARγ (C26H12) Rabbit mAb甲氧基

二十六烷(分析標(biāo)準(zhǔn)品, ≥99.5% (GC))SCD1 (M38) Antibody叔丁基-吡唑-5-

HIV(1+2)抗原ELISA試劑盒phospho-CSF1R(Tyr923)  酸化巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體20 ul

H5型病毒(H5N1)(IgG)ELISA試劑盒MCT1  單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-11000 ul

G蛋白偶聯(lián)受體152(GPR152/PGR5)ELISA試劑盒MCM2  微小染色體維持缺陷蛋白2200 ul

G蛋白偶聯(lián)受體109A(GPR109A)ELISA試劑盒MCM3  微小染色體維持缺陷蛋白3100 ul

G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(GPBAR1)ELISA試劑盒MCM5  微小染色體維持缺陷蛋白5100 ul

G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1(GPR30)ELISA試劑盒MCM7  微小染色體維持缺陷蛋白7100 ul

G蛋白偶合受體44(GPR44/CRTH2/DL1R)ELISA試劑盒MCSF  巨噬細(xì)胞克隆刺激因子100 ul

GTP酶NRas(NRAS)ELISA試劑盒Mcl1  髓樣細(xì)胞白血病-1100 ul

Gremlin-1蛋白(GREM1)ELISA試劑盒Phospho-Mcl1 (Ser159/Thr163)  酸化髓樣細(xì)胞白血病-120 ul
豌豆內(nèi)源基因PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)上皮鈉離子通道蛋白γ抗體1-Acetyl-4-piperidinecarboxylic acid中文名：1-乙酰基-4-哌啶甲酸別名：分子式：C8H133

胚胎干細(xì)胞RAS蛋白抗體(S)-4-(4-Amibenzyl)-2(1H)-oxazolidine中文名：(s)-4-(4-氨基芐基)-1,3-噁唑烷-2-酮?jiǎng)e名：分子式：C10H12N2O2

轉(zhuǎn)錄因子ETV7抗體2-Ami-3-Formylchromone中文名：2-氨基-3-甲酰基色原酮?jiǎng)e名：分子式：C10H73

真核翻譯延長(zhǎng)因子2抗體2-Amidiphenylamine中文名：鄰氨基二別名：分子式：C12H12N2

真核延伸因子激酶2抗體Acid Black 1中文名：酸性黑 1別名：分子式：C22H14N6Na2O9S2