犬新孢子蟲PCR檢測試劑盒說明書

注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
β-Alanine methyl ester hydrochloride大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞*培養(yǎng)基間硝苯 GR,99.0%

L-Aspartic acid dimethyl ester hydrochloride大鼠海馬神經(jīng)元細胞*培養(yǎng)基對甲苯胺 AR,99.0%

D-Aspartic acid dimethyl ester hydrochloride大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞*培養(yǎng)基對甲苯胺 99.7%

L-Aspartic acid β-methyl ester hydrochloride大鼠腦成纖維細胞*培養(yǎng)基間甲苯胺 GR,99%

L-Histidine methyl ester dihydrochloride大鼠神經(jīng)小膠質(zhì)細胞*培養(yǎng)基間甲苯胺 CP

DL-Alanine methyl ester hydrochloride大鼠雪旺氏細胞*培養(yǎng)基間甲苯胺 分析標準品，>99.7%

DL-Serine methyl ester hydrochloride大鼠小腦顆粒細胞*培養(yǎng)基土霉素  97%

L-Cysteine ethyl ester hydrochloride大鼠嗅鞘細胞*培養(yǎng)基1,1-二甲硫基硝基乙烯 98%

L-Tyrosine ethyl ester大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞*培養(yǎng)基2-溴-3-甲基吡啶 97%

DL-Alanine ethyl ester hydrochloride大鼠小梁網(wǎng)細胞*培養(yǎng)基5-溴-2-氟吡啶 98%

D-phenylglycine ethyl ester•HCl大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞*培養(yǎng)基(R)-(+)-N-叔丁氧羰基-3-氨基吡咯烷 97%

L-Arginine methyl ester dihydrochloride大鼠視網(wǎng)膜muller細胞(s)-(-)-N-叔丁氧羰基-3-氨基吡咯烷 98%

L-Tyrosine tert-butyl ester大鼠虹膜色素上皮細胞*培養(yǎng)基氯代二苯基膦 97%

N-Acetyl-L-tryptophan大鼠晶狀體上皮細胞*培養(yǎng)基5-氯-2-氟吡啶 99%

N-Acetyl-L-isoleucine大鼠角膜上皮細胞*培養(yǎng)基二苯基次膦酰氯 98%

N-Acetyl-L-lysine大鼠角膜內(nèi)皮細胞*培養(yǎng)基二苯基磷酸 99%

鹽酸伊立替康,(CPT-11)TRAF3/CD40bp (CD40 binding protein)  腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白3抗原SUGT1  SUGT1蛋白抗體

鹽酸伊立替康（標準品）TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6)  腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6抗原SUFU/Suppressor of Fused  抑制Hh信號通路蛋白SUFU抗體

硝酸異康唑TRAIL/Apo2L (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)  腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體/凋亡素2配體抗原Substance P Receptor/NK1R  P物質(zhì)受體抗體

硝酸異康唑(標準品)TRBF1 (Telomeric repeat binding factor 1)  端粒體復(fù)制結(jié)合因子1抗原Substance P  P物質(zhì)抗體

異維A酸TRIM32(tripartite motif protein 32)  TRIM32抗原Styk1  絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶STYK1抗體

異維A酸（標準品）Trop-2/Tpm2 peptide  原肌球蛋白抗原STXBP1/Munc18  神經(jīng)突觸前膜胞內(nèi)蛋白18抗體

美羅培南TSARG4(Testis and spermatogenesis related gene 4)  生精細胞凋亡相關(guān)基因4抗原streptomycin  鏈霉素抗體

美羅培南(標準品)TSGF(Tumor Specific Growth Fanctor)  惡性腫瘤特異性生長因子抗原Streptokinase  鏈激酶抗體

硫酸卡那霉素CIDEB peptide  CIDEB抗原Streptococcus suis 2  小鼠抗2型豬鏈球菌菌體蛋白抗體

硫酸卡那霉素(標準品)Tsg101(Tumor susceptibility gene 101 protein)  Tsg101抗原Streptococcus suis 2  2型豬鏈球菌菌體蛋白抗體
犬新孢子蟲PCR檢測試劑盒說明書人蛋白二化物異構(gòu)酶前體(PDI)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：500毫升

人蛋白激酶A(PKA)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT，避光5克

人蛋白激酶B(PKB)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT25克

人蛋白激酶C(PKC)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1克

人蛋白聚糖(PG)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克

人蛋白酪氨酸激酶(PTK/CD115)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT10克

人蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP/PTPase/CD148)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：500克

人蛋白磷酸酶(PP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：5克
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。