熒光-PCR法反應體系中的引物和dNTP濃度

　　熒光-PCR法反應體系中的引物和dNTP濃度：

　　1.定制引物的標準純度對于大多數PCR應用是足夠的。因脫鹽而除去的苯甲酰基和異丁酰基很少，因此不會干擾PCR。部分應用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產生是因為DNA合成化學的效率不是100％。這是個循環過程，在每個堿基加入時使用重復化學反應，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。

　　2.引物的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經常偏酸，會引起寡核苷的水解。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。

　　3.引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體,過低則降低產量。利用紫外分光光度計,可精確計算引物濃度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計算：

　　X mol/L＝OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)。

　　X：引物摩爾濃度,A、C、G、T：引物中4種不同堿基個數。

　　4.不要使用寡聚核苷酸作為標準，在EB染色的膠上估算引物濃度，因為引物和標準的染色能力根據序列不同而差異很大。

　　5.dNTP溶液呈酸性，普通廠家的dNTP溶液一般均未調pH，應用1mol/l NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將dNTP貯存液pH調至7.0，以保證反應的pH值不低于7.1。再用紫外分光光度計定量。配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存。多次凍融會使dNTP降解。

　　6.決定低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成，理論上在100μl反應體系中，4×dNTPs濃度若用20μmol/L，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列,50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。

　　7.在PCR反應中，dNTP應為50-200umol/L，當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現的錯誤摻入。

　　8.dNTP含有磷酸根，能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。其濃度變化將影響Mg2+的有效濃度。標準反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2+濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時，必須相應調整Mg2+的濃度。